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2022-NMicro-Dodd

2022-07-19

Clostridium sporogenes uses reductive Stickland metabolism in the gut to generate ATP and produce circulating metabolites

为什么读这篇文章

  • 这是Dylan Dodd最新的一篇文章
  • 这篇文章其实和他2017年的Nature paper以及2019年Annu Review都有一些关联
  • 是一篇很好应用代谢组学方法来研究microbiome的示范

Background

  • 肠道细菌的一个key problem是如何获取能量来维持它们的生长和physiology
  • Clostridium sporogenes 利用amino acids对来获取能量 (即Stickland reaction)。在以往的认知里，该途径通过oxidative pathways来产生APT，而通过reductive pathways来维持氧化还原平衡。
    • 但是有一些线索也表明reductive pathways也与能量守恒相关，具体有
    • proline reduction会产生质子进入细胞
    • cinnamic acid reduction 与ATP形成相关
    • aromatic amino acid代谢的gene cluster携带了birfurcating Acyl-CoA dehydrogenase，表明这个通路可能与能量形成相关，并涉及Rnf complex
  • 尽管有这些证据表明microbial metabolites可能来源于产生能量的catabolic pathways，但是缺乏实验证据
    • amino acid pairs在多大程度上被用于促进C. sporogenes生长
    • 哪些C. sporogenes 代谢物被gut产生并进入host
    • reductive stickland metabolism是否与ATP的形成相关
    • Rnf complex在amino acid metabolism以及in vivo fitness过程中起到什么作用
  • 这篇文章主要做的点，是研究这个还原途径是否也会产生energy，以及产生的microbial metabolites 是否会进入循环系统并影响host physiology

Results

C. sporogenes produces 15 metabolites in vitro.

  • C. sporogenes ATCC (American Type Culture Collection) 15579是一个从人类粪便中分离出来的蛋白水解厌氧菌，能够进行遗传编辑，从而是一个理想的model来进行研究
  • 在没有glocuse的条件下，发现C.sporgenes也能快速生长 （Fig 1a）
  • 在24h生长后，培养基中的氨基酸被消耗(Fig 1b), 并有15个代谢物在培养上清液中出现了累积(Fig 1c)，包括SCFA, Branched-chain fatty acids，以及aromatic fatty acids and amines.
  • 尽管这些代谢物是已知累积在human gut，但是生成宿主对代谢物的代谢途径还不是很清楚

C. sporogenes uses amino acids in ‘Stickland’ pairs.

  • 之前的研究表明C. sporgenes可以代谢amino acids in pairs, 通过stickland reaction。已知的可以促进菌群生长的pair包括：Arg/Ile, Ser/Pro, Val/Pro, Leu/Pro以及Ile/Pro, 但是全面的growth-promoting stikland pairs还没有被分析过
  • 作者进行了一个high-throughput, growth-based assay, 利用OD值进行评估，在加不加acetate的情况下，分析生长情况
  • 发现有一些substrate 组合可以大大增加生长速度。glucose是最robust，可以利用多种还原途径的底物，比如proline, arginine （Fig2a）
  • 此外，serine的comination也与glucose展示出类似的谱图，因为只需1步就能转变到pyruvate，从而通过底物的氧化磷酸化生成ATP (Fig 2a)。在作者的assay中，Ser/Arg组合显示出了最高的生长率，比其他高3倍以上(Fig 2b-c)。这个过程不需要acetate, 可能表明serine能够通过pyruvate来进行anabolic reaction
  • 另外加不加acetate显示出很明显的不同。在top10的stickland pairs中，8个BCFA（reductants）加proline或者proline类似amino acid (oxidants) ，表明这样的组合可以满足细胞的合成反应

C. sporogenes amino acid metabolites circulate in the host.

  • 为了评估C.sporgenes共享了哪些代谢物到host，进行了菌群移植，并对faeces, caecal contentes, plasma, 以及urine进行了绝对定量
  • 13 out of 15 metabolites 在faeces中被detected，经过1week colonization，其中4个能在plasma中鉴定到，包括5-aminovalerate (5-AVA), phenylpropionate (PPA), 3-(4-hydroxypheny)propionate (4-0H-PPA)， indole-propionate，1week后平均浓度~3uM (PPA)， ~100uM (IPA) (Fig 3a-b)
  • 抗生素处理后均下降到了检测限以下，证明它们是依赖于bacterial metabolism (Fig3b-c)

C. sporogenes pathways produce circulating metabolites

  • 这说明colonization可能引入了新的pathway到host来生成了这4个compounds
  • 针对5-AVA，构建了prdF mutant, 这个酶是控制L-Pro -> D-Pro转化的过程(Fig3d)。这个突变能够完全消除5-AVA （Fig3e）
  • 针对PPA，4-OH-PPA, 以及IPA构建了fldC以及acdA mutant，都能消除对应的代谢产物。colonization到小鼠上之后也都能重复(Fig3f)
  • 这些结果证明通过bacteria colonization可以引入代谢通路产生上述代谢物

Stickland metabolites circulate in human blood.

  • 这4个circulating metabolites也存在于human blood当中(Fig3g)

Circulating molecules are reductive Stickland metabolites.

  • 为了验证这4个循环代谢物是否来源于相同的amino acid, 进行了氘标实验。分别在培养基中加入4中氘标的氨基酸，在24h后基本上都被消耗完全完，生成对应的labelled derivatives (5-AVA (d6,d5), PPA (d7,d6,d5), 4-OH-PPA(d4)) (Fig4b)。尽管也存在其氧化通路，但是只有还原通路的产物被观察到
  • 然后进一步验证这些reductive metabolites的产生是否是受到氧化氨基酸伴侣的刺激。介于proline和valine单独刺激显示出先相对有限的substrate consumpation，使用两者共同刺激显示出了明显的消耗（Fig4d）。同样使用Phe/Val, 以及Trp/Val(Fig4d)。这些共同证明这些还原代谢物与coupled stickland reaction相关

Reductive Stickland metabolism is coupled to ATP formation.

  • 在经典的amino acid的Stickland metabolism中，氧化途径通过底物氧化磷酸化产生ATP，而还原途径主要是是维持氧化还原平衡。但是厌氧细菌却可以使用reductive metabolism来维持厌氧反之，这表明还有另外一种机制来获取能量。
  • 作者怀疑stickland的还原途径是否能够获得能量，因此进行了gene cluster分析，reductive amino acid patheay, 来发现潜在的能量获取机制
  • 发现每一个pathway都有一步设计了multi-subunit electron transfer protein （Fig 5a）. 这个aryl amino acid reductive gene cluse编码了acyl-coA途径，sharing 40-60%的氨基酸一致性（Fig 5b） Etfbcd）。对于proline，则有一种不同的electron transfer protein, proline reductase (Fig 5c). 这些BGC表明stickland的还原途径与electron transfer reaction有关，可能能产生ATP
  • 为了试验进行验证，作者搭建了一个whole-cell-based ATP assay使用C. sporogenes 的细胞悬浮液。然后使用还原途径的中间产物到细胞中，发现ATP水平确实有一个明显的上升(Fig.5d). 这些表明reductive Stickland metabolism 确实与ATP的形成相关，并生成了一个proton的驱动力

The Rnf complex is important for Stickland metabolism.

  • 作者去探究Rnf complex是否可能是一个重要的结合位点，通过gene cluster分析发现Rnf complex以及targeted gene (rnfB, rnfE)编码了2个subunits (Fig 6a). RnfB被认为是一个Rnf complex的入口，而RnfE则被认为是一个跨膜的protein (Fig 6b). - 两者任何一个的突变都会影响生长速率，但当加入glucose时，则可以抑制这种表型（Fig6c）
  • 相比于WT, rnfB的突变株消耗phenylalaning和tyrosine的速度要更慢，同时中间产物3-(4-hydroxyphenyl)lacate则有累积，表明这个还原途径被局部block了 (Fig 6d)。rnfB的突变株也会产生更少的IPA，积累更多的中间产物
  • 消耗Arg和Pro的途径与WT组没有明显变化，但是5-AVA的生成速率要明显更底（图上看不出来)，但有意思的一点是突变株消耗了更多的branched-chain amino acids,将它们covert成氧化产物（IBA, 2-Me-BA, IVA) (Fig 5d)
  • 这些说明rnfB确实会影响reductive Stickland metabolism, 从而有利于氧化通路代谢产物的生产。但是这个突变没有完全被blocked住，证明细胞还有其他途径来进行电子传递
  • 最后作者去探究in vivo中，stickland metabolties在Rnf complex 突变的条件下是否会改变。对突变和非突变的菌株进行coloniation, 然后有LC-MS来测量caecal contents和plasma. 相比于WT, rnfB突变组有相似的还原通路产物（没有明显差异），除了IPA （Fig6e）。因此，尽管Rnf complex可以影响stickland metabolism在培养基中，但是在mammalian intestin中会被回补掉

The Rnf complex is a fitness determinant within the gut.

  • 考虑到之前发现Rnf complex突变会在体外影响生长速率，作者就进一步去验证在体内是否有同样重要。同时移植WT和rnf突变，会发现rnf会被迅速的替代掉 (Fig. 6f)，在更复杂的移植条件下也是类似的(Fig. 6g)。
  • 这些结果表明Rnf complex能够帮助更有效的代谢，可能是通过link reductive stickland metabolism来产生proton gradient，进而产生ATP

Electron transfer proteins are widely distributed.

  • 进一步在NCBI的GenBank database中证明了Electron transfer protein是普遍存在的

感受

  1. 文章逻辑还是清晰的，证明了reductive stickland 反应产生了一些循环代谢物，并且可以生成ATP。另外这篇文章还是能够看到前一篇2017年nature文章的一些点
  2. 目前可以看到他们组主要还是分析一些常见的菌群代谢产物，15种，数目不是很多，但是做了很不错的绝对定量结果