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2022-Guo-Cell

2022-05-21

Genetic manipulation of gut microbes enables single-gene interrogation in a complex microbiome

为什么读这篇文章

  • 今天读完Chunjun Guo的2019年的Science文章，趁热打铁看一下今年的cell文章
  • 思考有没有可能将代谢组学应用到相关方面的可能
  • 学习和了解为主
  • BioArt

Introduction

  • 多组学方法已经发行了很多菌群基因与宿主biology相关，但其因果机制难以阐释，主要因为很多来自于非模式的菌株（如：厚壁菌门Firmicutes，梭菌Clostridia），此外这些菌株是没有被基因组测序（理论上这个不应该是简单的吗），该如何引入外源基因以及选择哪个工具都是未知的。
  • 目前没有一个方法，能够在没有基因组先验知识的背景下，能够进行基因转移并构建基因操作体系
  • 这样的流程将有3个好处：
    • 很多多组学显示出显著性关联的gene都只特定地表达在非模式菌株中。可以帮助揭示上述的因果关系
    • 已知gut microbiota发挥了重要调节作用，但是哪个菌和基因起作用却知之甚少。这个方法可以将先前无法靶标的基因变成可能
    • 揭示分子机制以及基因编辑用于菌群治疗
  • 本文的主要特点：
    • 鉴定了88个菌株（绝大多数都是非模式菌株）的外源基因转入方法以及遗传操作的工具。（请教了王博士，其实质粒sgRNA的转入就是外源基因的）

An overview of the GM pipeline

总览，面临的主要困难：

  1. 没有之前报道过的抗生素makers可以通用地应用于nonmodel microbes
  2. 对于厚壁菌和梭菌这些高丰度的非模式菌，没有遗传工具可以使用
  3. 许多isolated没有被完整测序

Selection of gut microbes and screening their culture conditions and antibiotic resistance

选择合适的菌株和抗生素：

  • 抗生素的最低抑制浓度是允许的（minimal inhibitory concerntration, MIC）
  • 能够有抑制作用但是对E. coli有活性

A multifactorial optimization to identify gene transfer methodology for nonmodel Clostridia

  • 进行了一系列的优化，具体细节不太能看懂，包括了
    • catP maker，Ppmty-catp以及Pfdx-cs可以引入抗生素抗性
    • 使用了E.coli Dcm methylase-free “sExpress” conjugation donor
    • 一些参数的优化
  • 结果：拥有41%的成功率，表明发展这种发展的可能性

Testing CRISPRi-dCpf1 system in multiple Clostridia commensals

  • 选择了CRISPRi-dCpf1: 不会导致双链的切断，低毒性以及高的接和效率。
  • 通过敲除clostridia普遍存在中的lacZa，证明了这个方法能够普遍适用于梭菌 （Fig 2b）

A strategy targeting bacterial 16S rRNA genes to generate targeted gene insertion tools in nonmodel gut commensals

Constructing mutants to modulate Clostridia gene transcription and microbiome metabolites production

  • 这个部分就和science那篇文章比较像了
  • 选择abundant producers，敲了SCFAs (mmdA, croA)，BSCFAs（porA）的一系列已知基因，证明这个方法可以用来调控代MDM

A case study of Clostridia-specific bile acid 7a-dehydroxylation

  • 选择这个通路的原因：
  1. 发现是122菌株可以高效地转换CA/CDCA，以及DCA/LCA
  2. DCA/LCA及其衍生化是宿主host secondary bile acid的主要组成
  3. 两性的bile acid具特殊的生物学功能

  • 通过生信分析以及发现潜在的bai外显子表明：

    1. 对S122进行测序并发现bai外显子在两个人群队列中大规模存在
    2. 和其他的7a脱羟基的比起来虽然基因组上丰度同样比较低，但宿主的肠道中却高度转录
    3. 比C. hiranonis 和C. scindens更普遍

  • 结果：

    • 体外突变成功，DCA明显下降，中间产物累积
    • 但是定植小鼠不成功，但发现可以和S25菌株一起定植（这个怎么发现的没讲），一起定植后就成功了

The baiH gene has significant effects on the host bile acid pool and microbiota composition

  • 在复杂的菌群体系(如SPF小鼠)中敲除baiH基因，但这个不好实现。正如作者所说，这SPF小鼠中已经有了一个复杂的菌落来进行7a脱羟活性。
  • 处理方法是control和baiH突变株中同时转入thiamphenicol marker，然后在小鼠的饮用水里加入thiamphenicol (15 mg/ml) and erythromycin (10 mg/ml)，从而实现相同的细菌载量 （粪便的16S rRNA sequencing）
  • 下面的数据分析比较简单：
    • PCoA分析表明聚类与突变显著相关
    • 突变和controly有明显不同的bile acid pool；conjugated BCA没有差别，表示其不会影响修饰的活性；DCA and its derivatives在control累积
    • knocking out baiH可以改变宿主microbiome的组成（这个很有意思）。

Assessing the effect of baiH on intestinal inflammation

  • 评估baiH在DSS诱导模型（疾病模型）中是否能够调节免疫
  • 设计：
    • 分别S122 control，S122 control + bai突变，肠道免疫变化明显
    • 但是当加入S25之后就没有明显的变化 （这个结果也很有意思）
  • 结论：baiH介导的炎症反应是依赖于微生物群的，而在复杂的微生物群中，baiH的减少会重塑宿主胆汁酸的形态，并预设肠道微生物组的组成，使其处于更有保护作用的对抗状态DSS-induced结肠炎

The baiH-mediated microbiota composition shift exacerbates DSS-induced colitis in gnotobiotic mice

  • 验证baiH突变在GF小鼠中造成的改变是否与在与DSS刺激对SPF小鼠造成的改变相关。
  • baiH 是否会在体内驱动丹毒科的扩张，以及这种微生物群组成的变

感受

  • 文章还是很一如既往的很有逻辑，对于做方法的人还是很好了解，即使像我这样完全没有遗传学操作的背景
  • 但有一个疑问，这篇文章为了验证和展示结果，都是选择比较熟知的gene进行操作，但是真正使用的时候，这些关键gene从哪里来？（人群队列的多组学数据可能是一个来源点）
  • 怎么有可能把这个方法和我熟悉的非靶向代谢组学技术联系起来？BGC那条路可能是一条；多组学数据出来的关键基因，逐个敲除，类似于文库，然后做非靶向代谢组学筛选，但这个可以回答的生物学问题是什么？