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2019-Guo-Science

2022-05-21

2019 Science Depletion of microbiome-derived molecules in the host using Clostridium genetics

为什么读这篇文章

  1. Chunjun Guo在Michael组另一个主要工作之一
  2. 利用CRISPER cas9对菌群进行遗传处理，是一个很突破的想法
  3. 学习的过程

Background

  • 小分子受关注的原因：
    • 大部分没有宿主来源，其含量完全或巨大部分直接由菌群决定
    • 很多可以进入bloodstream, 然后进入相关组织
    • 很多浓度达到甚至超过了一般的药物水平，因此有可能造成不同人之间的生物学差别
    • 有一些小分子的靶点是宿主的关键受体，如GPCRs, nuclear hormone receptors，在免疫和代谢过程中发挥重要作用
  • 大部分小分子对生命活动的影响未知，很大程度是缺乏一个通用的方法能够像模式动物那样对基因进行knockout
  • 之前的研究个体MDM对于宿主colonization的影响主要用两种策略：
    • 直接给药：化合物通过注射或灌胃给药，可以帮助了解作用机制，但缺乏清晰的背景（即目标分子的现有生理水平）。同时，相对于肠道细菌生产的天然环境，给药途径和时间差异的可能造成影响。
    • 去除或者加入生成这个MDM的菌株，这种方式是一种更加天然的方式，但是很难区别是molecule-induced表型还是组织的其他生命活动
  • 相比于以上几种，最好的方式应该是比较只在合成某个MDM上有差别的组织。要实现这个模式，需要两个前提：
    • 目标小分子的代谢基因
    • 在生产菌株中进行遗传操作的能力
  • 这个方法已经被用在了常规的菌株上，如拟杆菌Bacteroids, 大肠杆菌E. Coli, 乳酸菌Lactobacillus），但是对于能够产生很多高丰度的梭菌(Clostridium)及其相关的菌株均无法实现遗传操作，由于基因组的不稳定性
  • 本文通过开发了一个CRISPR-Cas9 based system来构建了单基因和多基因突变模型梭菌株

Selection of C. sporogenes as a model gut Clostridium

  • 选择了C. sporogenes ATCC 15579 (hereafter C. sporogenes)这个菌株的原因
    • 是一个已知稳定的小分子生产菌株
    • 能够稳定地被定植到germ-free的小鼠
    • 是一个共生和互惠的菌株, 不致病（即既不是pathogen也不是pathobiont）
  • 通过代谢组分析，明确能够生成上图中10个重要高丰度的MDM：5-aminovalerate, trimethylamine, tryptamine, indole propionate and other aryl propionates, isobutyrate, 2-methylbutyrate, isovalerate, isocaproate, propionate, and butyrate

Prediction and computational analysis of metabolic pathways

  • 第一步预测这些代谢合成通路
    • trimethylamine, tryptamine, and indole propionate 这三个是已知的，另外7个是没有被遗传学验证过的，通过以下三种方式之一进行预测：
      • 非微生物体系的通路验证（不懂）
      • 超酶家族，寻找直系同酶物
      • 丁酸基因簇的宏基因组分析，帮助在这个菌株中预测可能的基因簇
    • 再进一步通过宏基因组以及RNA seq分析验证这些基因在人群中是广泛存在且活跃转录的

Development of a CRISPR-Cas9–based genetic system for C. sporogenes

  • 通过一系列的尝试，使用了双质粒体系，并将第二个质粒的共培养时间从24h延长到72h的CRISPR-Cas9 体系

Constructing mutants to validate C. sporogenes pathways in vitro

  • 体外构建突变株
    • 证明2点，正确突变的，对应的化合物不会合成，证明正确突变
    • 没有被突变的保持正常
    • 发现isobutyrate, 2-methybutyrate 以及isovalerate的预测基因不正确，PorA基因才正确

In vivo modulation of C. sporogenes–derived molecules

  • 设计了4个单敲，1个双敲，敲除就能明显降低，结论：
    • 都显著降低了水平
    • isocaproate和butyrate减少的幅度较小，猜测原因，本身sporongenes这个菌产生这两个化合物的通量就比较低，以及基底的污染
    • 双敲菌株下降的尤其明显

Immune modulatory properties of branched SCFAs

  • 回到最初的目的，通过突变株去探究这些小分子在microbe-host interactions过程中的作用。
  • 选择branched SCFAs去进行分析的两个原因：
    • 已知的高丰度
    • 不像SCFAs已知可以通过GPCRs GPR41和43来调节宿主免疫，了解的很少
  • 通过分析5 week小鼠的免疫细胞，发现了绝大部分常见的immune function没有变化，但是双敲小鼠有明显的IgA-producing plasma cells的上调，并在很多天然免疫细胞里面存在。这是一个从来没有被报道过的branched SCFA功能
  • 但是在粪便样本中没有显著变化，之前报道过的是indole propionic acid

感受

  • 文章总体逻辑很清楚也很明显地从方法学角度进行了证明
  • 感觉需要对已知的菌群代谢小分子要做一个完整的调研