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2017-Guo-Cell

2022-05-21

2017 Cell Discovery of Reactive Microbiota-Derived Metabolites that Inhibit Host Proteases

为什么读这篇文章

  1. Michael组近几年文章中另外一篇从基因组出发发现MDM代谢物的文章
  2. Chunjun Guo在Michael组主要工作之一，另一篇是用CRISPER-Cas9进行遗传学操作
  3. 这篇文章可以看做是2014年那篇Cell的延续

Background

  • 菌群通过多种方式影响宿主，但是绝大多数在分子机制层面上是不清楚的
  • 2014 Doina的Cell paper表明人类基因组中存在数千个功能未知的生物合成位点（BGC），还包括一些在50%以上HMP队列样本中存在的大家族
  • 这些基因能够合成什么存在很大的gap，并且为发现新的meditor的调控机制提供了可能的契机
  • 从之前的数据出发，去表征了nonribosomal peptide synthetase (NRPS) gene clusters，基于以下2个原因：
    • 在90%以上的HMP stool样本中存在，证明其广泛存在
    • 绝大部分属于gut bacterial genome sequences，只有少量environmental isolates, 表明这些BGC生成的小分子可能在肠道中起到重要的interspecies signaling作用

Computational Analysis of the Gut NRPS Cluster Family

  • 新发现了19个，一共有47个BGC，具有以下特点：
    • 4个分支组成具备不同的特点，根据module，每一个都有终端还原酶domain
    • 均来自anaerobic firmicutes(厌氧厚壁菌门)和clostridia (梭状龅牙杆菌)，少数来自革兰阴性式杆菌
    • 几乎全来自于人类肠道或者其他mammals
    • 每个分支均包含一些没有被分离过的cluster
  • 从4个分支中选了14个cluster，由于这些菌株没有被遗传学操作过，且这类clostridia对于遗传学手段有抗性，因此没有使用敲除的方式，而是进行体外表达（Ecoli和Bacillus）

Experimental Analysis of the Gut NRPS Gene Clusters

  • 对上面表达的E.Coli进行LC-MS分析，然后分离纯化出其中bgc35和bgc52中的几个新峰，这些新峰是pyrazionones和dihydropyazionones
  • 问题：是怎么把目标定在pyrazionones和dihydropyazionones
  • 列举的几个理由：
    • 220和300nm的UV吸收符合pyrazinone core
    • HRMS的Mass和formula推断，α-amino-acid-derived pyrazinone和dihydropyazionones
    • 1D加2D核磁确认
  • 结论：7 out of 14个BGC中，鉴定到了32个化合物，其中28个是没有被报道过的

The Same Molecules Are Produced by a Native Strain and in a Biochemical Reconstitution

  • 下一个问题：这些化合物是天然产物还是表达产生的artifacts
    • 利用两个实验证明，第一天然表达这两种BGC的菌株在不同的培养体系下面去测，看看能不能测到上面的小分子，这个方法验证了bgc52，但是没有验证bgc35
    • 过表达bgc35 in Ecoli，然后纯化蛋白，体外重构了这个生物合成的通路，通过加底物，最后验证了2个compounds

The Gut NRPS Family Is Widely Distributed in Healthy Humans

  • 下一个问题：这些cluster是否在人群样本中广泛分布？
    • 用了两个方法去研究已有的宏基因组数据集做证明这些BGC的广泛分布：
      • 针对这些BGC，用mBLASTx的方法去做map HMP
      • 用了一个新的方法 gene catalog

Gut NRPS Clusters Are Actively Transcribed under Conditions of Host Colonization

  • 针对有些BGC存在于metagenomic sample但是不表达或者表达很低的情况，为了去address gut NRPS是否在正常的人里面能够被转录，去分析了已有的人群的RNA-seq数据

The Active Gut NRPS Product May Be the Initially Released Dipeptide Aldehydes

怎么猜出来这些是来源于dipeptide aldehydes没怎么看懂

  • 猜测这些products是来源于dipeptide aldehydes，基于3个原因

    • 测定了其中3个化合物的氧化半周期，在3-28h，表明有足够的时间在宿主中是稳定的，推导了前体Phe-Phe-H
    • 有很久的文献历史表明peptide aldehydes是蛋白酶抑制剂
    • in vitro实验测定了这几个化合物对于不同的蛋白酶的抑制活性

  • 最后用isoTOP-ABPP方法Phe-Phe-H找到bgc35的靶点

感受

  1. 首先是文章思路。刚读这篇文章的时候觉得前面的思路可能就是follow 2014年那篇cell，但是后面发现和那篇cell相比，这篇文章多了明显更多的生化方面的研究，并且做了一些机制上的探究。从BGC出发，到鉴定MDM，再推测来源，发现dipeptide aldehydes，然后证明具备其具备蛋白酶抑制活性及其中一个的靶点

  2. 之前纯天然产物方面的文章接触的很少，读完这篇文章还是有很多启发。

    • 对于未知物的鉴定。这篇文章先用大量体外的技术通过生化手段进行体外表达，然后通过分离纯化，结合LC紫外，LC-MSMS，以及核磁方面来共同鉴定MDM。这套方法应该是我要学习的方法，MetDNA2这个课题里面太拘泥于用纯bioinformatics的方法来发现，其实完全可以用文章中的这些方法来进行分离
    • 鉴定到的unknown可以做的更加深入，比如这篇文章，从人群角度去探讨，从应用如抑制剂角度，靶点去做分析，做到更深的深度

  3. 需要学习的方法自然有很多，最相关的还是BGC那一套，以及思考有没有可能将非靶向代谢组的数据和BGC做联用。